以Nut. Commun.最新文章為例│詳解藻類培養與表型研究產品應用：實驗室進化提高聚球藻的波動光耐受性

Background

在自然界中，光照強度時刻處于動態波動狀態，波動光（Fluctuating light, FL)脅迫一直是藍藻、微藻光合生長的重要制約因素。劇烈光強起伏會破壞光合系統、引發光抑制，不僅影響藻類天然生長，更嚴重限制了光生物反應器工程藻株培育、光合機理研究與作物耐逆育種挖掘。盡管已有關于關鍵FL耐受性組分的研究報道，但其遺傳機制等仍未明確：

? 已發現部分基因、蛋白參與波動光響應，但缺乏可應用的優良耐受等位基因；

? 傳統培養方式無法精準模擬梯度波動光，難以開展長期適應性實驗室進化（ALE）；

? 常規檢測手段只能測生長量，無法快速無損評估光合系統活性、篩選表型變異菌株；

? 恒定強光與波動光耐受機制獨立，普通培養和檢測體系難以區分兩類脅迫表型。

Solutions from Ecotech

在實驗室尺度，如何精準模擬自然波動光環境、實現藻類長期馴化培養？如何高通量篩選光合表型差異菌株、解析光耐受生理機制？這就不得不借助一些專業的科研設備：

v 藻類培養與在線監測技術

u LED光源精準調控，單個或多種光質、光強無極調控，自定義光照程序

u 環境參數控制：溫度、通氣、pH、濁度可控

u 實時監測生長曲線（OD）

u 實時監測葉綠素熒光、pH、溶解氧等

u 不同通道數、不同規模高通量培養：同步培養1到多個通道，容積從100mL到數十升

v 葉綠素熒光測量與成像技術

u 無損測量藻類熒光參數，靈敏反映光合活性

u 多場景應用，便攜式、臺式、顯微鏡式等型號，滿足各類場景需求

u 熒光成像系統高通量測量，可同時測96wells

u 多種內置測量程序，兼備調制式、非調制式測量功能

u 參考文獻眾多，數據、圖像可直接發文章

Typical case

接下來，我們以Nature Communications最新發表的文章（Improving tolerance to fluctuating light through adaptive laboratory evolution in the cyanobacterium Synechocystis）為案例，從實際研究出發，詳解易科泰藻類培養與研究技術的應用。

先說結論：

本研究通過在兩種FL條件下（其中一種對起始菌株具有致死性，記為LT）對集胞藻PCC 6803進行進化改造，依靠標準化藻類馴化培養 + 光合熒光表型精準監測全套技術，篩選出Pam68、RpaB、Sll0518 三大關鍵突變基因，其中Pam68（PSII 組裝蛋白）和Sll0518基因突變可增強對非致死性FL的耐受性；而RpaB（藻膽體結合調節因子B）的功能獲得性缺失突變則顯著增強了對致死性FL及強光條件的耐受性。

n 實驗室適應性進化，高效選育FL耐受菌株

ALE：指在實驗室條件下通過人為選擇壓力促使微生物（如聚球藻屬）逐步進化獲得特定性狀（如高光耐受性）的研究方法。本研究中設計了FL0、FL +兩套方案，歷時 20 個月、20 輪培養，對聚球藻進行了兩種波動光方案下的ALE處理，過程依托 MC1000 8通道藻類培養與在線監測系統實現高精度控制。

n 單克隆高通量初篩分型

對馴化的培養物接種于固體培養基并在恒定LL20光照條件下培養，隨后分離出單個克隆并培養，之后對單克隆菌落，利用FluorCam葉綠素熒光成像系統進行原位熒光成像，測定PSII 量子產率 Fv/Fm。依托該功能，從百余個克隆中篩選出覆蓋表型多樣性的通過對12株FL0和12株FL+單克隆菌株并進行全基因組分析（以這些適應性菌株的來源菌株LT以及原始可運動型集胞藻PCC 6803菌株[標記為“WT"]作為對照），獲得了含412個突變的突變矩陣。大幅降低測序成本、提升篩選效率。

n 共有突變基因—Pam68功能鑒定

為驗證基因功能，對Pam68過表達菌株（pam68oe），Pam68_S113G，pam68基因敲除突變體（ins0933）h在LL12和FL0final培養條件下進行比較（下左圖）

為評估該S→G突變在不同物種中的適應潛力，在集胞藻LT和ins0933菌株中分別表達了野生型AtPAM68（AtPAM68WT）和AtPAM68S174G，并在LL50、HL700及FL0final條件下觀察其生長情況。（下右圖）

以上菌株的培養也在MC1000中完成，再次證明了這套系統在藻類全測量培養和研究階段的重要作用。

n 特異突變基因—rpaBT183P功能鑒定

   利用FluorCam葉綠素熒光成像系統，對rpaBT183P突變菌株進行非光化學熒光淬滅測量，以鑒定基因在光系統結構功能方面的作用。結果表明rpaBT183P對光系統化學計量比及外周天線結構的積累具有差異性影響：該基因通過下調藻膽體捕光容量、調控狀態轉換、重塑PSI/PSII化學計量比、提升CEF（環式電子傳遞）活性實現光保護，且存在低光生長與強光耐受的權衡。

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